L’ischemia cerebrale è indotta mediante l’occlusione dell’arteria cerebrale media (MCAo) usando la tecnica, relativamente non-invasiva, del filamento intraluminale, come descritto da Longa et al. (1989) con piccole modifiche. I topi (23-26 g) o i ratti (280-320 g) sono anestetizzati con isoflurano al 5% in aria durante la fase di induzione, poi mantenuto alla minima concentrazione efficace (1,5-2%) durante la procedura chirurgica. La temperatura corporea è misurata con una sonda rettale e mantenuta a 37°C mediante l’uso di un tappetino riscaldato. Con l’ausilio di uno stereomicroscopio, le arterie carotidi interna ed esterna destre sono esposte attraverso un’incisione a livello del collo. L’arteria carotide esterna è recisa ad una distanza di circa 2 mm dalla biforcazione dell’arteria carotide comune e legata lassamente in prossimità della biforcazione con un filo di seta per sutura. Un filamento di nylon ricoperto di silicone (diametro: 0,37 mm per i ratti e 0,23 mm per i topi, Doccol Corporation, Redlands, CA, USA) viene, quindi, inserito nella carotide esterna e fatto avanzare lentamente nella carotide interna (11 mm nei topi e 18 mm nei ratti dalla biforcazione carotidea), fino ad incontrare una leggera resistenza, indicativa dell’avvenuta occlusione all’origine dell’arteria cerebrale media in corrispondenza del circolo di Willis.

Il filo di seta viene tirato per stringere il nodo attorno al filamento al fine di prevenire il sanguinamento. Per dar luogo alla riperfusione, il filamento è rimosso 30 minuti (topi) o 2 ore (ratti) dopo l’MCAo. Dopo aver richiuso la ferita con punti metallici, la somministrazione dell’anestetico è interrotta per consentire il risveglio degli animali, che sono poi trasferiti nelle gabbie con libero accesso a cibo e acqua. Gli animali sham sono sottoposti alla stessa procedura chirurgica senza occlusione della MCA.

Per la quantificazione del danno ischemico gli animali sono sacrificati a specifici tempi dopo l’induzione dell’ischemia e i cervelli sono rapidamente prelevati e congelati.

Nei ratti, il volume di infarto cerebrale è valutato mediante la colorazione delle fettine cerebrali con 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC).

Il TTC è utilizzato da più di 50 anni per l’identificazione delle aree di danno tissutale ischemico. Si tratta di un sale solubile in acqua che nel tessuto cerebrale in condizioni normali viene ridotto dalla succinato deidrogenasi mitocondriale in formazano, un composto insolubile di colore rosso. Nel tessuto ischemico, questi sistemi enzimatici mitocondriali risultano compromessi e, di conseguenza, le aree infartuate non si colorano.

L’impiego di sali di tetrazolio come indicatori di enzimi respiratori mitocondriali è considerato un metodo riproducibile nella valutazione del danno ischemico nell’intervallo compreso tra 2,5 e 36 ore dopo l’induzione dell’ischemia. A tempi più tardivi l’intensa attivazione microgliale e l’infiltrazione dei leucociti, in cui i mitocondri sono perfettamente funzionali, potrebbero mascherare la presenza di un infarto tissutale (Liszczak et al., 1984). Pertanto, per valutare il volume di infarto 2, 3 o 7 giorni dopo l’MCAo, i cervelli sono prelevati e immediatamente congelati in isopentano a -20 °C. I cervelli vengono successivamente tagliati al criostato per ottenere sezioni coronali di 20 µm a intervalli di 2 mm (per i ratti) o di 0,5 mm (per i topi) dal bulbo olfattorio fino al cervelletto. Le sezioni sono montate su vetrini Superfrost-plus e colorate con cresil violetto. A tal fine, i vetrini vengono immersi in etanolo assoluto a -80°C per 15 minuti e successivamente in soluzioni acquose di etanolo al 100, 90, 70, 50%, ciascuno per un minuto e alla fine in acqua distillata per un minuto.

Al fine di valutare la variazione dello stato neurocomportamentale dei topi e dei ratti sottoposti a occlusione dell’arteria cerebrale media viene utilizzato il metodo(modificato) di Bederson. La scala originale a 4 punti sviluppata da Bederson et al. (1986b) è stata modificata ed ampliata fino a 6 punti (Tabella 3-1 ) assegnando agli animali un valore “score” da 0 a 5 correlato alla severità del danno cerebrale indotto da MCAo.